Analiza datelor publice

Datele despre liniile SARS-CoV-2 și data la care a fost prelevată proba din secvențele disponibile din Chile au fost obținute de la site-ul Consorcio Genomas CoV2 disponibil la https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Datele de vaccinare au fost obținute din datele publice de la Ministerul Științei, Tehnologiei, Cunoștințelor și Inovării disponibile la https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Produsul 83).

Testul de infectare

Virușii pseudotipați care poartă diferite proteine spike SARS-CoV-2 au fost pregătiți așa cum am descris anterior¹². Pe scurt, pseudotipurile SARS-CoV-1 pe bază de HIV-2 au fost produse în celule HEK293T prin transfectarea pNL4.3-ΔEnv-Luc împreună cu vectorul de codificare Spike pCDNA-SARS-CoV-2 corespunzător într-un raport molar 1:1. Plasmide care codifică un vârf optimizat pentru codon, lipsit de ultimii 19 aminoacizi ai capătului C-terminal (SΔ19), cunoscut pentru a evita reținerea la reticulul endoplasmatic¹² au fost obținute prin sinteza genelor sau mutageneză personalizată direcționată pe site (GeneScript) și au conținut următoarele mutații: filiație A (secvență de referință), filiație B (D614G), filiație B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), filiație P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027, ΔG, Δ37) 75- 76, L246Q, F252S, D452G, T490N). Fiecare preparat pseudotip a fost curățat prin centrifugare la 614 rpm la temperatura camerei, cuantificat folosind kitul ELISA HIV-859 Gag p3,000 Quantikine (R&D Systems), alicotat în ser fetal bovin (Sigma-Aldrich) 1% și păstrat la -24 °C până la utilizare. Au fost utilizate cantități diferite de viruși pseudotipați (după cum este determinat de nivelurile proteinei HIV-50 p80) pentru a infecta celulele HEK-ACE1 și 24 de ore mai târziu, activitatea luciferazei de licurici a fost măsurată folosind reactivul de testare a luciferazei (Promega) într-o microplacă Glomax 2. luminometru (Promega).

Test de neutralizare

Testele de neutralizare a virusului pseudotipizat au fost efectuate în esență așa cum am descris anterior¹². Pe scurt, diluțiile în serie ale probelor de plasmă (1:4 până la 1:8748) au fost preparate în DMEM cu 10% ser fetal bovin și incubate cu 5 ng de p24 din fiecare virus pseudotipizat timp de 1 oră la 37 ° C și apoi, 1 x 10⁴ de celule HEK-ACE2 au fost adăugate la fiecare godeu. Celulele HEK293T (care nu exprimă ACE2) incubate cu virusul pseudotipizat (linie A) au fost utilizate ca martor negativ. Celulele au fost lizate 48 de ore mai târziu, iar activitatea luciferazei de licurici a fost măsurată utilizând reactivul de testare a luciferazei (Promega) într-un luminometru cu microplacă Glomax 96 (Promega). S-a calculat procentul de neutralizare pentru fiecare diluție și s-a calculat ID50 al fiecărei probe folosind GraphPad Prism versiunea 9.0.1.

analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul GraphPad Prism versiunea 9.1.2. Comparațiile cu mai multe grupuri pentru titrurile de anticorpi de neutralizare (NAbT) față de un panou de virusuri pseudotipizate SARS-CoV-2, precum și comparații ale răspunsurilor NAbs în funcție de sex și starea de fum au fost efectuate folosind un test Wilcoxon pereche. Modificarea factorului a fost calculată ca diferență a titrului medie geometrică în ID₅₀ comparativ cu cel al virusului pseudotipizat de tip Wild. Analiza corelației dintre NAbT și vârstă sau IMC a fost efectuată folosind testul Spearman. ANOVA unidirecțională și testul de comparație multiplă Tukey au fost efectuate pentru analiza statistică a infecțiozității. O valoare p ≤0.05 a fost considerată semnificativă statistic.

Aprobarea etică

Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al Facultății de Medicină de la Universidad de Chile (Proiectele N° 0361-2021 și N° 096-2020) și Clínica Santa Maria (Proiectul N° 132604-21). Toți donatorii au semnat consimțământul informat, iar mostrele lor au fost anonimizate.

Impactul mutațiilor cu vârf în varianta Lambda asupra răspunsurilor infecțioase și neutralizante a anticorpilor

O analiză a 3695 de secvențe din Chile depuse la GISAID la 24 iunie^th 2021 arată o dominație clară a variantelor SARS-CoV-2 Gamma și Lambda în timpul ultimului trimestru reprezentând, împreună, 79% din toate secvențele.

Interesant este că această perioadă a fost caracterizată printr-o campanie masivă de vaccinare în care 65.6% din populația țintă (persoane cu vârsta de 18 ani și peste) au primit o schemă completă de vaccinare la 27 iunie.^th 2021

Având în vedere că 78.2% dintre persoanele inoculate cu o schemă completă au primit vaccinul cu virus inactivat CoronaVac de la Sinovac Biotech, am căutat să investigăm impactul mutațiilor spike prezente în varianta Lambda asupra capacității de neutralizare a anticorpilor provocați de acest vaccin.

Pentru aceasta, am generat virusuri pseudotipizate SARS-CoV-1 pe bază de HIV-2, purtând proteina spike din descendența de referință Wuhan-1 (tipul sălbatic; descendența A), mutația D614G (filiația B) și Alpha (liniația B). .1.1.7), variante Gamma (filiație P.1) și Lambda (filiație C.37).

În timpul pregătirii virusului, am observat în mod constant că celulele infectate cu virusul pseudotipizat purtând vârful Lambda au produs valori semnificativ mai mari de bioluminiscență în comparație cu mutantul D614G sau cu variantele Alpha și Gamma, ceea ce indică o infectivitate crescută determinată de proteina Spike Lambda.

Figura 1.Infectivitate mediată de diferite proteine spike.

(A) Reprezentare schematică a proteinei spike SARS-CoV-2 și a variantelor utilizate în acest studiu. Liniile sunt indicate în paranteză. RBD, domeniu de legare la receptor, CM; coada citoplasmatică.

(B) Titrarea pseudotipurilor fiecărei filiații folosind cantități echivalente de HIV-1 p24. Activitatea luciferazei de licurici a fost măsurată ca unități de luminiscență relativă (RLU) la 48 de ore după infecție. Media și SD au fost calculate dintr-un experiment reprezentativ în trei exemplare.

Apoi, am folosit virusurile pseudotipizate menționate mai sus pentru a efectua teste de neutralizare folosind 79 de probe de plasmă de la lucrători sănătoși din domeniul sănătății de la Universidad de Chile și Clínica Santa María din Santiago, Chile.

Am exclus 4 probe, deoarece nu am putut calcula un titru ID50. Din eșantioanele analizate, 73% au corespuns femeilor, vârsta medie de 34 de ani (IQR 29 – 43) și un indice body max (IMC) de 25 (IQR 22.7 – 27). Un procent de 20.5% dintre participanți s-au declarat fumători activi cât a durat perioada de imunizare. Probele au fost obținute într-o medie de 95 de zile (IQR 76 – 96) după a doua doză de vaccin CoronaVac

Am observat că neutralizarea virusului pseudotipizat care poartă proteina Spike de tip Wild a dus la o diluție inhibitoare de 50% (ID₅₀) titrul mediu de 191.46 (154.9 – 227.95, 95% CI,), în timp ce a fost de 153.92 (115.68 – 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 – 163.2, 95% CI), 104.57 (75.02 – 134.11, 95% CI), 78.75 – 49.8 %, IC 107.6, 95% ) și 614 (XNUMX – XNUMX, XNUMX% CI) pentru virusurile pseudotipizate care poartă proteina spike de la mutantul DXNUMXG sau variantele Alpha, Gamma și, respectiv, Lambda.

De asemenea, am observat că media geometrică a titrului ID₅₀ titrurile au scăzut cu un factor de 3.05 (2.57 – 3.61, IC 95%) pentru virusul pseudotip care poartă vârful Lambda, 2.33 (1.95 – 2.80, CI 95%) pentru vârful Gamma, 2.03 (1.71 – 2.41, IC 95%) pentru vârful Alpha și 1.37 (1.20 – 1.55, 95% CI) pentru vârful D614G în comparație cu vârful de tip Wild.

Nu a fost observată nicio corelație între sex, vârstă, indicele de masă corporală (IMC) sau starea de fum și titrurile de anticorpi neutralizanți în cohorta noastră de studiu.

Figura 2.Test de neutralizare folosind probe de plasmă de la vaccinați CoronaVac

(A) Modificări ale titrului de neutralizare reciproc de 50% (ID₅₀) în probe de plasmă de la 75 de primitori ai vaccinului CoronaVac împotriva D614G (linea B), Alpha (linea B.1.1.7),

Variante Gamma (filiația P.1) și Lambda (filiația C.37) în comparație cu virusul de tip sălbatic. Rezultatele sunt prezentate ca diferență în titrurile de neutralizare ale probelor potrivite. Valori P pentru compararea ID₅₀ sunt calculate cu testul Wilcoxon de rang semnat.

(B) Diagramele cu casete au indicat intervalul median și intercuartil (IQR) al ID₅₀ pentru fiecare virus pseudotipizat. Modificările factorilor sunt afișate ca diferență a titrului medie geometrică în ID₅₀ în comparație cu cele pentru virusul pseudotipizat de tip Wild. Analizele statistice au fost efectuate utilizând testul Wilcoxon pentru perechile semnate.

Împreună, datele noastre au dezvăluit că proteina de vârf a variantei de interes recent recunoscută Lambda, care circulă foarte mult în Chile și țările din America de Sud, poartă mutații care conferă infecțiozitate crescută și capacitatea de a scăpa de anticorpii neutralizanți provocați de CoronaVac.